PARTE EXPERIMENTAL: REPRODUCCIÓN IN VITRO DEL ERIZO DE MAR
OBJETIVOS:
- Una vez estudiadas y valoradas las distintas técnicas de extracción de gametos, elegir la más adecuada y extraer los gametos del erizo.
- Realizar la fecundación de esta especie marina a través de las técnicas de fecundación in vitro.
- Identificar los gametos y las distintas fases del desarrollo embrionario, desde el cigoto hasta la larva pluteus.
- Estudiar la movilidad de los espermatozoides en disoluciones con distintos compuestos contaminantes como el vinagre y el amoniaco y sacar conclusiones sobre el impacto humano en la reproducción de las especies marinas.
- Fotografiar todos y cada uno de los resultados obtenidos.
MATERIALES:
- Especímenes de erizo de mar.
- Esterilizador de biberones.
- KCl
- Agua destilada
- Agua de mar
- 2 Cápsula de Petri
- 3 Vaso precipitado de 200 ml.
- Jeringuillas estériles
- 3 cubreobjetos
- 3 portaobjetos
- Pipetas Pasteur
- Vinagre
- Amoniaco
- Detergente
- Microscopio
- Cámara digital
METODOLOGÍA
Es preciso decir que todos los utensilios y materiales que usemos deben estar esterilizados, así como el agua de mar. Para ello primero la filtraremos y posteriormente hervir el agua a 100 º C durante 45 min.
1. Obtener especímenes de Erizos de Mar:
Para ello nos desplazaremos a la localidad gibraltareña de Tarifa y los conseguiremos en las playas de dicha ciudad.
2. Mantener vivos los erizos de mar antes de la práctica:
Una vez conseguidos los erizos los mantendremos vivos en un recipiente de agua salada y los alimentaremos con algas o comida de peces. Debido a la dificultad de la tarea, intentaremos realizar la práctica lo más rápido posible para mantener con vida los erizos.
Una vez que hemos considerado todos los métodos que existen para la extracción de gametos, hemos elegido el “estímulo químico”, que consiste en aplicar una solución de KCl (cloruro de potasio) al 0,5 M . Con éste método el erizo evacua sus gametos y no muere.
3. Preparar la disolución de KCl 0.5 molar:
- Depositar 37.3 gramos de KCl en un matraz de
- aforo.
- Agregar agua destilada hasta completar un litro.
- Mezclar.
4. Extracción de los gametos
Tomamos el erizo, lo invertimos (con la zona oral hacia arriba) y le inyectamos 5 ml de solución KCl 0,5M con una jeringa. Luego se sacude suavemente el erizo para mezclar la solución de KCl dentro de él. En esta etapa como no sabemos el sexo del erizo se debe esperar la salida de los gametos. La coloración de los ovocitos es roja y de los espermatozoides blanca. La eyaculación de los gametos se realizará por la parte aboral.
Posteriormente colocamos al erizo macho en una cápsula de Petri sin agua de mar y a la hembra la dejamos en un vaso precipitado con agua de mar. Luego esperamos a que los erizos eyaculen todos los gametos.
5. Observación de los gametos:
Es preciso decir que para observar los espermatozoides hay que diluirlos, ya que es tan alta la concentración que al no realizar una dilución sería imposible su observación.
Tomamos con una pipeta Pasteur un poco del líquido blanquecino liberado por el erizo macho y depositamos una pequeña gota en la cápsula de Petri, luego agregamos 10 gotas de agua de mar y mezclamos. Colocamos una gota de esta solución en un portaobjeto, le colocamos un cubreobjetos y lo observamos al microscopio. Repetimos esta operación con el líquido rojizo de la hembra y hacemos fotografías de lo observado.
6. LA FECUNDACIÓN
1. En la mayoría los organismos marinos la fecundación es “externa”, es decir, los gametos son liberados al ambiente y la unión de estas células se realiza en el mar. Por ser un proceso de fecundación externa, las especies presentan algunos mecanismos para reconocer los gametos de la misma especie, en este caso los ovocitos, poseen una capa de gelatina que reconoce e interactúa sólo con los espermatozoides de erizos negros. Para hacer más fácil la fecundación dejaremos que los óvulos decanten en el fondo del vaso y con mucho cuidado eliminaremos el sobrenadante (agua de coloración amarillenta) y agregaremos agua de mar limpia. Este procedimiento lo realizaremos dos veces. De esta manera eliminaremos una cubierta de gelatina que protege al óvulo.
2. Con una pipeta Pasteur extraemos tres muestras de óvulos (líquido rojo) y los depositamos en un vaso pp. Agregamos 150 ml de agua de mar. Luego extraemos con otra pipeta una muestra de espermatozoides y la depositamos en el vaso pp. de los óvulos. Agitamos el vaso suavemente, esperamos un minuto y sacamos una gota de la solución para observarla al microscopio. Luego hacemos fotos de todo lo observado.
7. FASES DEL DESARROLLO EMBRIONARIO
Dejamos el vaso precipitado con los huevos fecundados en un lugar seguro a temperatura ambiente, y en los tiempos indicados a continuación, extraemos una muestra del vaso y depositarla en un portaobjetos, para luego observarla al microscopio y fotografiar todas las observaciones.
Estado de desarrollo Tiempo
Primera división 1,5 a 2 horas
Segunda división 2,5 a 3 horas
Blástula 24 horas
Gástrula 2 días
Larva Pluteus 4 a 5 días
8. MOVILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES EN DISTINTOS MEDIOS
Agregamos 1 ml. de vinagre a una solución de espermatozoides, y observamos como este compuesto (pH ácido) afecta su movilidad.
Repitemos la experiencia agregando 1 ml. de amoníaco (pH básico) ó 1 ml. de detergente. Anotaremos todos los resultados obtenidos y sacaremos las respectivas concluisones.
