Presentación

Este blog será usado para publicar en él todo el desarrollo de un proyecto de investigación que será presentado en Alumnos Investigadores 2011. El proyecto tratará sobre la fecundación in vitro y contará con una parte experimental en la cual fecundaremos erizos de mar, estudiando su desarrollo embrionario. Esperamos que os sea de utilidad.

Resultados parte experimental

2.3.4.1 PRIMER INTENTO DE FIV EN ERIZOS

-          Fecha: 9-02-11
-          Lugar: laboratorio de ciencias, colegio Mª Auxiliadora, Algeciras.

                                                                             
                                                                           laboratorio
la
-          procedencia de los erizos: playas de  Málaga
-          tamaño: reducido excepto el macho
-          Empezamos con 19 especímenes de erizos de mar, pero como la mayoría eran de un tamaño reducido, nos vimos obligados a reducir el número de erizos a 4 especímenes.


Erizos de mar                                                                    

Erizo de mar macho



Se consiguió preparar la disolución de KCl al 0.5 M y la posterior estimulación química de los erizos inyectándoles 1.5 ml de disolución a cada uno por la parte oral. El macho expulsó líquido blanquecino espeso (espermas) y las hembras expulsaron gotas rojas en menor cantidad (óvulos), que fueron mezclados con agua de mar.


Estimulación con KCl


Erizo maco expulsando gametos


Gametos masculinos (izquierda) y femeninos (derencha)


Espermatozoides diluidos
-         
La muestra de espermatozoides se diluyó con agua de mar y pudo ser observada al microscopio a un aumento de 400x. La movilidad de los espermatozoides era fácilmente visible: al principio era más energética; pasado un tiempo apenas era visible el movimiento, por lo que los espermatozoides habían muerto.


                                           


Espermatozoides al microscopio (400x)

-          La muestra de óvulos de los 3 erizos hembras se llevaron al microscopio para su posterior observación, pero ésta no pudo ser realizada a causa del tamaño de los erizos: al ser tan pequeños se pone en duda la madurez de los gametos femeninos.
-          Conclusión: La fecundación no pudo ser realizada ya que, aunque fuimos capaces de extraer gametos femeninos, no pudieron ser observados y concluimos que no eran aptos, al contrario que los espermatozoides.

2.3.4.2    SEGUNDO INTENTO DE FIV EN ERIZOS

-          Fecha: 24-02-11
-          Lugar: laboratorio de ciencias, colegio Mª Auxiliadora, Algeciras.
-          Fueron utilizado 15 especímenes de erizo de mar con un tamaño bastante pequeño, ya que no pudimos encontrarlos de un tamaño superior. Los erizos fueron capturados por nosotros mismos en la zona rocosa de la playa de Torreguadiaro (Cádiz). A la dificultad de la maduración de los erizos también hay que añadirle que los erizos estaban casi muertos cuando realizamos la práctica.




                                                                           Erizos de mar

-          De todos los erizos estimulados con ClK solo 4 expulsaron los gametos, y todos eran hembras. Además, de todas las muestras de óvulos observadas solo se pudo ver con claridad una muestra, por lo que solo un erizo estaba maduro. En este caso los óvulos no fueron diluidos en agua para no dificultar la observación al microscopio.


                                                         Estimulación de los erizos con KCl

                            


                                       Erizo de mar hembra expulsando los óvulos (líquido rojizo)


Observación de los óvulos al microscopio:



-          Conclusión: no pudo realizarse la fecundación ya que no encontramos erizos machos para obtener espermatozoides, además de que los erizos estaban casi muertos y a las hembras que conseguimos extraerles los óvulos tenían estos muy inmaduros.

2.3.4.3    TERCER INTENTO DE FIV EN ERIZOS

-          Fecha: 25-02-11
-          Lugar: Domicilio personal



-          Disponíamos de 10 ejemplares de erizos de mar bien maduros, de muchas tonalidades y con espinas muy largas (objetivo que nos planteamos en el anterior intento debido a que los gametos expulsados por los erizos de tamaño pequeño eran inmaduros) recogidos en las playas de Algeciras.


-          De los 10 erizos solo nos hizo falta estimular a 3 de ellos, los cuales dos eran macho y uno hembra. La estimulación como se explica en el proyecto ha sido realizada inyectándole por la cara oral al erizo 0.5 ml de una disolución de KCl 0.5M. Posterior a la extracción de gametos mezclamos en un portaobjetos una gota de semen con 5 de agua y de igual manera con los óvulos para observarlos al microscopio y verificar su madurez.


Estimulación del erizo macho


Desovación de los gametos masculinos


Gametos de erizo mezclado con agua de mar



Espermatozoides al microscopio


Desovación del erizo hembra





Óvulos de erizo al microscopio

-          Después de observar los gametos llevamos a cabo el proceso de fecundación, tomando tres muestras de óvulos y una de espermatozoides y mezclándolo todo en un vaso precipitado con 100 ml de agua de mar. A continuación sacamos una muestra para llevarla al microscopio y observar la fecundación, realizando fotografías y vídeos de este proceso. La fecundación será considerada el tiempo 0.


Óvulos y espermatozoides mezclados en agua de mar




Espermatozoides alrededor del óvulo intentando fecundarlo.

-          Después de la fecundación, a distintas horas fuimos tomando muestras de la preparación de óvulos fecundados para distinguir las distintas fases del desarrollo embrionario. Conseguimos distinguir claramente las fases de la segmentación, el estadio de blástula, la gastrulación y la gástrula. Sin embargo, no pudimos observar con claridad el estadio de larva pluteus, seguramente debido que las condiciones del agua de mar no eran aptas para que el embrión se desarrollara hasta ese estado. Aun así pudimos ver un embrión que es probable que se estuviera convirtiendo en la larva, aunque nos es del todo fiable. Estas son las fotografías y sus correspondientes estados y horas:



Segmentación: 1ª división (dos células)
1 hora



Segmentación: 2ª división (4 células)
2.5 horas



Segmentación: 3ª división (8 células)
3 - 3.5 horas


Mórulas en distintas fases de la segmentación
3 horas


Segmentación: mórula de 16 células
5 horas


Segmentación: mórula de 32 células
20 horas

Segmentación: mórula de cerca de 60 células
1 día



Blástula
Un día y medio




Gastrulación (gástrula temprana)
2 días y medio










Larva pluteus
4 días

-          Después de conocer y fotografiar todas las fases del desarrollo embrionario se realizó un esquema del desarrollo embrionario en erizos de mar y otro de los gametos:



-          Resultados y conclusión: hemos conseguido el principal objetivo del proyecto, conseguir la fecundación y observar buena parte del desarrollo embrionario. Sin embargo, el estado de larva pluteus no se aprecia con claridad, debido probablemente al estancamiento del agua donde se encontraban.

2.3.4.4    CUARTO INTENTO DE FIV EN ERIZOS

-         Fecha: 1-04-11
-         Lugar: domicilio personal
-         Disponíamos de 10 ejemplares de erizos de mar procedentes del mar cantábrico, pero estos no tenían mucha vitalidad debido al viaje hasta Algeciras. Tenían un gran tamaño y las espinas eran más pequeñas que las de los utilizados en los otros experimentos.



-         Estos fueron estimulados por la disolución de KCl, pero sólo uno de ellos desovó los gametos, en este caso femeninos.




 Estimulación con KCl

 Los óvulos fueron observados al microscopio:



-          Conclusión: no se pudo realizar la fecundación in vitro debido a que de todos los erizo estimulados, ninguno erizo macho consiguió desovar, probablemente porque estaban casi muertos.


2.3.4.5    QUINTO INTENTO DE FIV EN EIZOS DE MAR

-          Fecha: 03-04-11
-          Lugar: domicilio personal
-          Los erizos utilizados en este experimento fueron capturados por nosotros mismo en las playas de San Diego (Málaga). Eran de un tamaño considerable, de tonos oscuros y con espinas muy largas.



-          De todos los erizos estimulamos 8 de ellos mediante estimulación química con cloruro potásico. Se comprobó que los erizos estaban bien maduros pues la mayoría desovaron en gran cantidad, tanto machos como hembras.


Erizo macho desovando
           

Erizo hembra desovando

-          Del líquido expulsado por el erizo macho se tomó una gota y se mezcló en una cápsula de Petri con 10 gotas de agua de mar para poder observar la movilidad de espermatozoides. A esta solución se le añadió un ml de vinagre y se comparó la movilidad de los espermatozoides en los dos medios a través del microscopio, observando que los espermatozoides perdían su movilidad en la solución con vinagre. Este hecho se grabó en video. El líquido rojizo expulsado por las hembras también fue diluido con agua para observar mejor los óvulos al microscopio.

Espermatozoides de erizos de mar al microscopio.

Óvulos de erizo de mar al microscopio.
-          Posteriormente se realizó la fecundación, mezclando en 100 ml de agua de mar una muestra de espermatozoides y 3 muestras de óvulos.


Mezcla de espermatozoides y óvulos.

-          De esta mezcla se tomó una muestra para observar al microscopio el momento de la fecundación.


Óvulo ya fecundado con espermatozoides alrededor.


Comparativa entre óvulos fecundados y no fecundados: en el óvulo fecundado se observa una capa externa formada para evitar que entre más de un espermatozoide al óvulo.

-          Finalmente, se fueron extrayendo muestras a distintas horas para estudiar el desarrollo embrionario. Los embriones solo pudieron ser observados hasta el estadio de mórula de 60 células.

DESARROLLO EMBRIONARIO




Segmentación: 1ª división (dos células)
1.5 horas




Segmentación: 2ª división (cuatro células)
3 horas
  

Segmentación: 3ª división (ocho células)
5 horas



Segmentación: cuarta división (mórula de 16 células)
8 horas
  


Segmentación: quinta división (mórula de 32 células)
1 día y cinco horas
   

Segmentación: mórula de más de 60 células.
1 día y medio

-          Conclusión: se realizó la fecundación in vitro, pero solo pudimos observar los embriones hasta el estado de mórula de más de 60 células. A partir de ahí los embriones empezaron a morir. Las causas las desconocemos, aunque creemos que se debe al agua de mar donde se mantienen o a la gran cantidad de embriones que comparten la misma agua.